2 收藏 0 阅读
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭 (见第 9 步）
蒸馏水
DNA 点样染料
30% 甘油
70% 蒸馏水
0.003% 溴酚蓝
0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)
溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)
蒸馏水
重新扩增混合液（见第 7 步）
2. 核酸和寡核苷酸
任意引物（H-AP)(2 mmol/L)
cDNA(切割的条带），来自方案 5
dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)
未标记的锚定引物（H-T11M)(2umol/L)
载体特异性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]
3. 酶和酶缓冲液
10XPCR 缓冲液
100 mmol/LTris-HCl,pH8.4
500 mmol/LKCl
15 mmol/LMgCl2
0.01% 明胶
TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 专用设备
电泳装置
1.5 ml 离心管
Parafilm
热循环仪
0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)
UV 透射仪
微波炉
5. 附加试剂
PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括准备好插入的 PCR-TRAP 克隆载体、T4DNA 连接酶（200u/ul)、蒸馏水、10X 连接缓冲液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl2，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)
6. 细胞
GH-competent 细胞
7. 特别项目
含有抗生素的琼脂平板（参考克隆系统推荐的专用抗生素与方案）
二、方法
1. 将方案 5 中切下的条带，放到 1.5 ml 离心管中，加入 1ml 蒸馏水。
2. 浸泡 30 min，时常涡旋混匀。
3. 除去蒸馏水（不要丟掉条带），再加入 50ul 新鲜的蒸馏水。
4. 将离心管盖紧（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，将 cDNA 从凝胶中洗提出来。
5. 离心 lmin，浓缩并收集凝胶。
6. 将上清液转移到一个新的 1.5 ml 离心管中，弃去装有凝胶的管子。
7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列组分完成 cDNA 的重新扩增。
蒸馏水 22.6ul
10XPCR 缓冲液 4.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.0ul
H-AP 引物（2umol/L) 4.0ul
H-T11M(2umol/L) 4.0ul
cDNA 模板 4.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.4ul
8. 将重新扩增的反应液放在热循环仪上，以最初 PCR 条件（见方案 4 第 1 步）进行反应。
9. 配制含有溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶。
a. 在玻璃烧瓶中，称 1.5 mg 超纯的电泳级琼脂糖。
b. 加 1XTAE 至 100 ml。
c. 将琼脂糖放到微波炉中熔化。
d. 冷却后，加入 3ul1:1 的溴化乙锭溶液。
e. 混匀后，倒入凝胶装置中。
f. 放好梳子，等胶凝固。
g. 电泳缓冲液为 1XTAE 溶液（凝胶装置不同，用量也不同）。
10. 在 0.5 ml 的离心管中，加入 30ul 的再扩增反应液和 5ul DNA 点样染料。将混合液全部加到 1.5% 琼脂糖凝胶上。
11. 在 70V 电压下电泳大约 45 min。
12. 用 UV 透射仪进行观察，以确认 cDNA 再扩增反应产物。
13. 按照厂商给的方案，将差异表达的 cDNA 克隆到推荐的 PCR-TRAP 克隆载体或其他合适的载体中。
14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的载体特异性引物进行测序。如果使用其他的克隆载体，请参考厂商的测序说明书。
您知悉并同意，丁香通平台展示产品并非为平台自身产品，您发起询价或试用申请后，平台将会把您已提供或按要求提供的相关信息同步提供至所咨询的具体产品商家，由商家为您提供具体产品的价格咨询或产品试用注意事项及相关试用产品或完成相应购买，因此您知悉并授权平台将您的信息进行同步共享。您有权拒绝，但您知悉将无法参加询价或试用活动。
